熒光現(xiàn)象

熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長光照射下，幾乎同時(shí)發(fā)射出波長更長光的過程。當(dāng)特定波長的光照射一個(gè)分子時(shí)，光子能量被該分子的電子吸收。接著，電子從基態(tài)躍遷至較高的能級，即激發(fā)態(tài)。這個(gè)過程稱為激發(fā)。電子在激發(fā)態(tài)停留10-9–10-8秒，在此過程中電子損失一些能量。電子離開激發(fā)態(tài)并回到基態(tài)的過程中，會(huì)釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量。

熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時(shí)間為熒光壽命，一般為納秒級別，是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像，可以在熒光強(qiáng)度成像之外，更加深入地進(jìn)行功能性精準(zhǔn)測量，獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。

熒光的另一個(gè)重要特性是Stokes位移，即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長差異。通常發(fā)射光波長比激發(fā)光波長更長。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前，電子經(jīng)過弛豫過程會(huì)損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

熒光顯微鏡及熒光濾塊

熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動(dòng)態(tài)過程的追蹤等等。

細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光，想要觀察它們，要進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多，可以直接標(biāo)記，或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色，也可以用熒光蛋白標(biāo)記目標(biāo)蛋白，還可以用可逆結(jié)合的合成染料等。

目前熒光顯微鏡已成為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室及成像平臺(tái)的標(biāo)配成像設(shè)備，是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)的好幫手。熒光顯微鏡主要分為三大類：正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、熒光體視鏡。

熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件，由激發(fā)濾片、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成，安裝在濾片轉(zhuǎn)輪里，不同的顯微鏡轉(zhuǎn)輪位數(shù)會(huì)有區(qū)別，也有些顯微鏡使用濾塊滑板。

濾塊在熒光成像中起著重要作用：激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來激發(fā)樣品，阻擋其他波長的光；通過激發(fā)濾片的光經(jīng)過二向分光鏡，反射后通過物鏡聚焦，照射到樣品，激發(fā)出對應(yīng)的熒光即發(fā)射光，發(fā)射光被物鏡收集，透過二向分光鏡，到達(dá)發(fā)射濾片。

熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長通和帶通兩種類型。帶通通常由中心波長和區(qū)間寬度確定。

熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)（吸收）曲線和發(fā)射曲線，激發(fā)峰為Z佳激發(fā)波長，發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長范圍。因此，在實(shí)驗(yàn)中，我們會(huì)盡可能選擇與激發(fā)峰Z接近的波長進(jìn)行激發(fā)，而接收范圍需包括發(fā)射峰。

濾塊的詳細(xì)信息可以在顯微鏡成像軟件里看到。了解染料并找到Z匹配樣品的濾塊對于熒光成像有著至關(guān)重要的作用。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說明書中會(huì)注明，也可在網(wǎng)上查閱。

濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā)、發(fā)射波長，對于多色標(biāo)記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā)、是否串色。此外還需考慮所使用的熒光光源，目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素?zé)?，以及近年來飛速發(fā)展的LED光源。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的，在不同波段能量也會(huì)不同。LED光源因?yàn)槠湎鄬^窄的光譜帶、更穩(wěn)定的能量輸出、超長的壽命、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)，正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源。

除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊，還有外置快速轉(zhuǎn)輪。

熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛，種類豐富，而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn)，大家可以選擇Z適合的技術(shù)去完成自己的研究。