激光掃描共聚焦熒光顯微鏡是一種利用計算機(jī)、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器。主要用于觀察活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化，定量分析，以及實時定量測定等。
 

　　成像原理
 

　　采用點光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，*終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像 ，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機(jī)，*終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。
 

　　每一幅焦平面圖像實際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個光學(xué)橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面(焦平面)掃描與Z軸(光軸)掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測針孔。
 

　　激光共聚焦的工作原理簡單表達(dá)就是它采用激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機(jī)控制來進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。
 

　　基本結(jié)構(gòu)
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號處理器、計算機(jī)以及圖像輸出設(shè)備等。
 

　　（1）掃描模塊
 

　　掃描模塊主要由針孔光欄(控制光學(xué)切片的厚度)、分光鏡(按波長改變光線傳播方向)、發(fā)射熒光分色器(選擇一定波長范圍的光進(jìn)行檢測)、檢測器(光電倍增管)組成。熒光樣品中的混合熒光進(jìn)入掃描器，經(jīng)過檢測針孔光欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進(jìn)行檢測并形成相應(yīng)的共焦圖象，同時在計算機(jī)屏幕上可以顯示幾個并列的單色熒光圖象及其合成圖象。
 

　　（2）熒光顯微鏡系統(tǒng)
 

　　顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可方便地在其中插入光學(xué)選件而不影響成像質(zhì)量和測量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場復(fù)消色差物鏡，有利于熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺的移動調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計算機(jī)自動控制。
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點：需與掃描器連接，使激光能進(jìn)入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達(dá)檢測器；需有光路轉(zhuǎn)換裝置，即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時汞燈光線強(qiáng)度可調(diào)。
 

　　（3）常用激光器
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)，常用的激光器包括以下三種類型：
 

　　半導(dǎo)體激光器：405nm(近紫外譜線)
 

　　氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm(藍(lán)綠光)
 

　　氦氖激光器：543nm(綠光-氦氖綠激光器)633nm (紅光—氦氖紅激光器)
 

　　UV激光器(紫外激光器)：351 nm、364 nm(紫外光)
 

　　（4）輔助設(shè)備
 

　　風(fēng)冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源。
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發(fā)射的一定波長的激發(fā)光，光線經(jīng)放大后通過掃描器內(nèi)的照明針孔光欄形成點光源，由物鏡聚焦于樣品的焦平面上，樣品上相應(yīng)的被照射點受激發(fā)而發(fā)射出的熒光，通過檢測孔光欄后，到達(dá)檢測器，并成像于計算機(jī)監(jiān)視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點的熒光圖像組成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片。