看到感興趣的照片，我們會(huì)情不自禁點(diǎn)開放大。但這種放大不是無(wú)限的，Z終我們的好奇心會(huì)終止在一個(gè)模糊的像素點(diǎn)，無(wú)法更清晰。是光的內(nèi)稟屬性造成了這一限制。突破光學(xué)衍射J限是科學(xué)界很有名的挑戰(zhàn)之一，至今仍沒(méi)有很好的方案。浙江大學(xué)物理學(xué)院張德龍研究員課題組另辟蹊徑，提出“從頻域提取空間特征”的思路，發(fā)明了一種無(wú)標(biāo)記的超分辨率方法——光熱弛豫定位（PEARL）顯微鏡。PEARL顯微鏡直接從光熱顯微鏡的探測(cè)光束的位置依賴性調(diào)制中提取亞衍射J限特征，它不依賴于熒光標(biāo)記，分辨率可達(dá)到120納米左右。

相關(guān)研究成果以“Super-Resolution Imaging of Non-fluorescent Molecules by Photothermal Relaxation Localization Microscopy” 為題1月23日在線發(fā)表于Nature Photonics。論文**作者為浙江大學(xué)物理學(xué)院博士生傅鵬程，通訊作者是浙江大學(xué)物理學(xué)院張德龍研究員。

尋找光斑里的細(xì)節(jié)

張德龍的實(shí)驗(yàn)室，無(wú)菌細(xì)胞房緊挨著光學(xué)儀器平臺(tái)。他希望有一天生命體的精細(xì)結(jié)構(gòu)能被更清晰、更便捷地觀察，這一領(lǐng)域存在一項(xiàng)很有名的挑戰(zhàn)：突破衍射J限。

衍射J限是由光的“本性”決定的。光是一種電磁波，由于存在衍射現(xiàn)象，一個(gè)被觀測(cè)的點(diǎn)經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)成像后得到的是一個(gè)衍射像，每個(gè)物點(diǎn)就像一個(gè)彌散的斑。當(dāng)兩個(gè)點(diǎn)靠得很近時(shí)，彌散斑就像“粘”一起，是一團(tuán)模糊的圖像。1873年，德國(guó)科學(xué)家阿貝提出了“衍射J限”理論：分辨率的J限近似于入射光波長(zhǎng)的二分之一(d=λ/2)。該理論認(rèn)為，我們觀察物體時(shí)的分辨率J限，取決于我們用什么波長(zhǎng)的光去觀察。這類似于我們畫畫，使用什么樣的筆決定了筆觸的精細(xì)程度，是奔放的潑墨山水，還是細(xì)致的花鳥工筆。

圖1. 艾里斑與瑞利判據(jù)。

（圖片來(lái)源：https://www.opticsjournal.net/M/Articles/OJbf8d38a472e80dcb/FullText）

可見光的波長(zhǎng)通常在380~780納米之間，根據(jù)衍射J限公式可以得出，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率J限在200納米（0.2微米）左右。這個(gè)分辨率在觀察更小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)（例如脂質(zhì)或蛋白質(zhì)微滴）就顯得捉襟見肘了。也許你會(huì)說(shuō)，可以用更短波長(zhǎng)的光來(lái)提高成像分辨率，但是短波長(zhǎng)的光具有的更高的光子能量，這會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。

在科學(xué)家眼中，J限就是用來(lái)突破的。多年來(lái)，突破衍射J限已經(jīng)成為科學(xué)界一項(xiàng)公認(rèn)的挑戰(zhàn)，眾多科學(xué)家提出了超分辨的思路與方法并應(yīng)用于實(shí)際。Z具有代表性的是2014年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的超分辨熒光顯微技術(shù)。借助熒光分子的幫助，科學(xué)家將光學(xué)顯微成像技術(shù)的J限拓展到了納米尺度。

“2014年諾獎(jiǎng)為代表的超分辨顯微成像技術(shù)嚴(yán)重依賴于熒光標(biāo)記，實(shí)際我們看到的是熒光標(biāo)記，而不是觀測(cè)對(duì)象本身?！睆埖慢埥榻B，近年來(lái)，擺脫熒光依賴，利用“無(wú)標(biāo)記”實(shí)現(xiàn)超分辨成像的科學(xué)探索開始成為研究熱點(diǎn)，有望能為下一代顯微鏡提供新的技術(shù)方案。在這篇研究論文中，浙大團(tuán)隊(duì)提出了他們的全新方案：基于光熱弛豫定位顯微鏡（Photothermal Relaxation Localization Microscopy, PEARL）的非熒光分子超分辨成像系統(tǒng)。

來(lái)自海市蜃樓的啟發(fā)

我們可以把海市蜃樓現(xiàn)象作為了解PEARL的入口。海市蜃樓是光線在在密度不同的氣層中穿行時(shí)發(fā)生折射的結(jié)果，就像光穿過(guò)透鏡，讓原本直線傳播的光線發(fā)生了偏折。張德龍說(shuō)，PEARL就是試圖在被觀測(cè)物中引入“透鏡”，讓成像系統(tǒng)通過(guò)捕捉電磁波的“偏折”信息，從而獲得精確的圖像。

分子在遇到特定波長(zhǎng)的電磁波時(shí)，會(huì)吸收電磁波能量并加速分子振動(dòng)。微波爐就是利用了這一原理對(duì)食物進(jìn)行加熱的。當(dāng)電磁波消失后，加熱后的分子就進(jìn)入能量耗散的放熱階段，這在物理學(xué)中被稱為光熱弛豫。對(duì)于科學(xué)家想觀察的生物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，雖然組成細(xì)胞的同一類分子吸收的能量是一樣的，但是他們的光熱升溫效果在空間上有所區(qū)別，總的來(lái)說(shuō)是中心處升溫大，邊緣處升溫小。而當(dāng)電磁波消失，邊緣的熱量要比中心的熱量耗散得更快。

圖2. PEARL成像原理

“我們利用分子的熱弛豫現(xiàn)象，將分子吸收能量的特征和其空間位置信息聯(lián)系起來(lái)。通過(guò)捕捉不同熱弛豫過(guò)程的高頻差異，對(duì)特定的分子進(jìn)行定位?！睆埖慢埥榻B。我們不妨想象夜空里星星“眨眼睛”的情景，星星忽明忽暗地閃爍，實(shí)際上是由于大氣密度分布不均勻造成光線的偏折造成的。“PEARL技術(shù)就好比通過(guò)‘眨眼’的快慢程度，來(lái)分辨出星星的細(xì)節(jié)?！?/span>

PEARL系統(tǒng)主要由泵浦光和探測(cè)光組成。泵浦光是波長(zhǎng)可調(diào)諧的激光，用于激發(fā)特定的分子，它以脈沖的形式聚焦到目標(biāo)物體上，引發(fā)分子光熱弛豫；探測(cè)光則進(jìn)行持續(xù)的掃描，通過(guò)分子的“熱弛豫”形成的“熱透鏡”序列擾動(dòng)探測(cè)光的傳播，這種擾動(dòng)的信號(hào)里蘊(yùn)含著分子的位置和光譜信息。由于“熱透鏡”的存在，擾動(dòng)的探測(cè)光產(chǎn)生了時(shí)間和空間上的變化。這一調(diào)制效應(yīng)帶來(lái)的突破是：在高次諧波頻率上，能夠探測(cè)到更精細(xì)的空間結(jié)構(gòu)，能夠突破探測(cè)光的衍射J限分辨率。

圖3. PEARL成像表征

為活細(xì)胞“寫生”

在研究中，浙大團(tuán)隊(duì)展示了用PEARL來(lái)觀察酵母細(xì)胞中一類細(xì)胞器—脂滴。酵母是生物學(xué)上廣泛使用的模型生物。單個(gè)酵母細(xì)胞大小約2 - 4 微米，而其內(nèi)部的脂粒通常只有0.05—0.5微米左右，傳統(tǒng)的紅外成像方法無(wú)法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行高分辨觀察。他們首次使用PEARL顯微鏡對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞遠(yuǎn)場(chǎng)紅外振動(dòng)光譜成像。實(shí)驗(yàn)不僅成功展示了細(xì)胞內(nèi)的脂滴的分布情況，還測(cè)定了它們的大小分布。此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了小尺寸的脂滴和一對(duì)蛋白滴（每個(gè)約170 納米）之間有細(xì)微的空間分離結(jié)構(gòu)?！拔覀?cè)诮湍傅腣-PEARL成像中觀察到的Z小特征是86 納米，這是**次用遠(yuǎn)場(chǎng)紅外成像分辨出100 納米以下的特征?！辈┦可爹i程介紹到。

圖4. PEARL哺乳動(dòng)物細(xì)胞成像

圖5. PEARL酵母細(xì)胞成像

當(dāng)前，超越衍射J限的光學(xué)成像已經(jīng)形成巨大的突破。與廣泛采用的基于熒光的方法相比，無(wú)標(biāo)記成像避免了標(biāo)記的需要和相關(guān)的潛在細(xì)胞毒性問(wèn)題。然而，現(xiàn)有的非熒光的超分辨成像方法往往依賴于飽和效應(yīng)或者非線性，其普遍適用性受到這些因素的限制?！拔覀冮_發(fā)的是一種無(wú)標(biāo)記的超分辨率方法，并突破了上述限制?！睆埖慢垙?qiáng)調(diào)，該技術(shù)不需要特殊的吸收體，因?yàn)镻EARL依賴于一般的吸收過(guò)程，包括電子和振動(dòng)吸收?！拔覀兿嘈?，PEARL可能為非熒光分子的超分辨率成像開辟了新的途徑，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域獲得令人興奮的廣泛應(yīng)用?！?/span>

此項(xiàng)工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（12074339，32050410293，11934011），量子科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃（2021ZD0303200），浙江大學(xué)腦與腦機(jī)融合前沿科學(xué)中心資助項(xiàng)目，中央高校基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)資金的支持。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41566-022-01143-3

原文章鏈接：http://physics.zju.edu.cn/2023/0214/c39070a2715958/page.htm