激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊,激光光源,熒光顯微鏡,數(shù)字信號(hào)處理器,計(jì)算機(jī)和圖像輸出裝置。
一、掃描模塊
激光共聚焦顯微鏡中的掃描模塊主要由針孔光闌(控制光學(xué)片的厚度),分束器(根據(jù)波長(zhǎng)改變光傳播方向),熒光分色器(選擇特定波長(zhǎng)范圍的光)和檢測(cè)器(光電倍增管)組成。
熒光樣品中的混合熒光進(jìn)入掃描儀,經(jīng)檢測(cè)針孔光闌,分束器和分色器選擇后,將其分為單個(gè)單色熒光,分別在不同的熒光通道中檢測(cè)并形成相應(yīng)的共焦圖像。同時(shí),可以在計(jì)算機(jī)屏幕上顯示幾個(gè)平行的單色熒光圖像及其合成圖像。
二、熒光顯微鏡系統(tǒng)
顯微鏡是激光共聚焦顯微鏡的主要組成部分,它與系統(tǒng)的成像質(zhì)量有關(guān)。具有無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)的顯微鏡光學(xué)路徑便于將光學(xué)選項(xiàng)插入其中,而不會(huì)影響成像質(zhì)量和測(cè)量精度。
物鏡應(yīng)為大數(shù)值孔徑平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡,有利于熒光的清晰采集和成像。物鏡組的轉(zhuǎn)換,濾色器組的選擇,載物臺(tái)的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)以及焦平面的記憶鎖定應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。
激光共聚焦顯微鏡中使用的熒光顯微鏡通常與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相同,但它有其特點(diǎn):需要與掃描儀連接,以便激光可以進(jìn)入顯微鏡物鏡照亮樣品,樣品發(fā)出的熒光到達(dá)檢測(cè)器;轉(zhuǎn)換裝置,即汞燈和激光轉(zhuǎn)換,以及水銀燈線的強(qiáng)度是可調(diào)節(jié)的。
三、常用激光器
激光共聚焦顯微鏡使用激光源,如單激光和多激光系統(tǒng)。常用的激光器包括半導(dǎo)體激光器、氬離子激光、氦氖激光和紫外激光。
四、輔助設(shè)備
風(fēng)冷,水冷式冷卻系統(tǒng)和穩(wěn)壓電源。激光共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先從激光器發(fā)射一定波長(zhǎng)的激發(fā)光。在光被放大之后,通過掃描儀中的照明針孔形成光源,并且物鏡聚焦在樣品的焦平面上。
由相應(yīng)的照射點(diǎn)發(fā)射的熒光被激發(fā),通過檢測(cè)孔,到達(dá)檢測(cè)器,并在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上成像。因此,焦平面上的樣本的每個(gè)點(diǎn)的熒光圖像構(gòu)成稱為光切片的完整共焦圖像。