來(lái)源：小小光08 

1引言根據(jù)阿貝定律，當(dāng)一個(gè)點(diǎn)光源經(jīng)過(guò)一個(gè)完善的光學(xué)系統(tǒng)后，由于光的衍射效應(yīng)，z終仍然形成的是一個(gè)模糊的光斑像(艾里斑)，光斑的半峰全寬滿足FWHM≈0.61λ/NA，其中λ為該光學(xué)系統(tǒng)的工作波長(zhǎng)，NA為該光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。上式也是一個(gè)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(PSF)的半高全寬的描述。它說(shuō)明：如果一次把處于這個(gè)半徑里面的粒子亮起來(lái)，那用光學(xué)顯微是無(wú)法分辨它們的。所以，這個(gè)公式也就是光學(xué)顯微分辨率的描述。一個(gè)光學(xué)成像系統(tǒng)的分辨率取決于兩個(gè)點(diǎn)光源像之間的z小距離，如果要提高成像分辨率，則需減小其工作波長(zhǎng)或提高系統(tǒng)的數(shù)值孔徑(通常采用高數(shù)值孔徑的物鏡)。對(duì)于常見(jiàn)的工作在可見(jiàn)光波段的光學(xué)顯微鏡，其分辨率J約為200nm。那么如何在現(xiàn)有的情況下進(jìn)一步提高系統(tǒng)的成像分辨率，從而突破衍射J限限制的分辨率成像呢？隨著科研人員的不斷探索，通過(guò)多種不同的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，小于100nm的分辨率得以實(shí)現(xiàn)。這些可以突破衍射J限成像的高分辨率光學(xué)顯微技術(shù)，稱為超分辨成像技術(shù)。根據(jù)其原理的不同，現(xiàn)有的超分辨成像技術(shù)可以分為兩大類：一類是基于單分子定位成像的方法，利用特殊熒光分子的光開(kāi)關(guān)特性或者其他機(jī)制在不同時(shí)刻隨機(jī)激發(fā)稀疏的熒光點(diǎn)，通過(guò)相應(yīng)算法對(duì)熒光分子進(jìn)行定位；另一類是改造成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)突破衍射J限分辨率的成像。2 基于單分子定位的超分辨成像第Y類方法基于分子定位實(shí)現(xiàn)的超分辨成像，主要包括光激活定位顯微技術(shù)(Photoactivated localization microscopy, PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(Stochas-tic optical reconstruction microscopy, STORM)。具有光開(kāi)關(guān)特性的熒光蛋白是這類技術(shù)的關(guān)鍵。2002年，Patterson等頭次發(fā)現(xiàn)了一種熒光蛋白PA-GFP，它在未激活狀態(tài)下不發(fā)光，用405nm的激光激活一段時(shí)間后，才能被488nm激發(fā)光激發(fā)，發(fā)出綠色熒光信號(hào)。2006年，Betzig 等利用這種具有開(kāi)關(guān)特性的熒光蛋白結(jié)合單分子熒光成像技術(shù)，頭次提出了PALM。

圖1：PALM用于觀察溶酶體跨膜蛋白同年，莊小威等利用熒光蛋白Cy5在不同激發(fā)波長(zhǎng)下表現(xiàn)出的開(kāi)關(guān)特性，提出了“隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù) (STORM) ”。

圖2：STORM技術(shù)原理當(dāng)兩個(gè)發(fā)光團(tuán)太接近的時(shí)候，傳統(tǒng)顯微鏡不能分辨。莊小威的想法就是，如果能夠用兩種顏色的光，一束通過(guò)光漂白，讓大部分粒子激發(fā)過(guò)度到達(dá)暗態(tài)；另一束通過(guò)激活，讓J個(gè)別暗態(tài)的粒子再激活過(guò)來(lái)。由于激活的是J少數(shù)。這樣，就有一部分粒子是只有自己發(fā)光、周邊都是不發(fā)光的，就可以很容易地把它定位出來(lái)；把它激發(fā)、漂白，再激發(fā)另外的一些粒子，如此往復(fù)。而且，她發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要的Cy3-Cy5對(duì)，發(fā)不同顏色的光，這一對(duì)熒光團(tuán)過(guò)去被用在熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET成像研究中。莊小威在進(jìn)行感冒病毒的研究中偶然發(fā)現(xiàn)，這一對(duì)可愛(ài)的蛋白能夠像開(kāi)關(guān)一樣，通過(guò)光控制它們或者發(fā)熒光，或者不發(fā)熒光。PALM與STORM的原理大致相同，都是利用反復(fù)激活-漂白熒光分子，從而獲得稀疏的熒光分子的位置信息，經(jīng)過(guò)上百次的循環(huán)迭代，將得到的細(xì)胞內(nèi)所有熒光分子的精確定位重構(gòu)到同一張圖像上，z后可以獲得分辨率比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍的顯微圖像。不同的是，STORM可以用來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨定位。然而，從PALM和STORM的基本原理中可以發(fā)現(xiàn)，這兩類超分辨成像技術(shù)所依賴的還是傳統(tǒng)的光學(xué)顯微系統(tǒng)，其光學(xué)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)并沒(méi)有發(fā)生改變，即單次成像分辨率依然處于衍射J限內(nèi)，它是“用時(shí)間換空間”，通過(guò)犧牲時(shí)間分辨率來(lái)獲得高的空間分辨率。3基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)改造的超分辨成像這類方法通過(guò)改造光源來(lái)壓縮光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)，實(shí)現(xiàn)超分辨成像，這類成像手段主要包括受激發(fā)射損耗(Stimulated emission depletion, STED)顯微技術(shù)，結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(structured illumination microscopy, SIM)，可逆飽和線性熒光躍遷(reversible saturable optical linear fluorescence transitions)顯微技術(shù)等。STED顯微技術(shù)z早于1994年，由Stefan W. Hell等提出，通過(guò)受激發(fā)射損耗的方式來(lái)改變熒光基團(tuán)發(fā)射熒光的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。一些熒光分子在激發(fā)光照明下處于激發(fā)態(tài)，但當(dāng)用另一束比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的激光照射時(shí)，熒光分子可以從激發(fā)態(tài)猝滅回到基態(tài)，即在兩束激光同時(shí)照射時(shí)發(fā)光?；谶@樣一種熒光特性，Hell等用一束激光照射樣品的同時(shí)，用另一束高能脈沖激光形成緊挨的環(huán)形激光照明，波長(zhǎng)比激發(fā)光稍長(zhǎng)，這樣被短波激發(fā)的熒光大部分通過(guò)受激發(fā)射損耗的過(guò)程猝滅，壓縮了點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，提高了顯微鏡的分辨率。然而STED的成像需要對(duì)樣品進(jìn)行點(diǎn)掃描，并且所采用的激光光強(qiáng)過(guò)大，可能導(dǎo)致觀測(cè)樣品的光漂白甚至光毒性。同時(shí)STED成像的光路復(fù)雜，系統(tǒng)搭建成本也較高。

圖3：典型的STED系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖圖3中，綠箭頭代表粒子被激發(fā)從低能級(jí)S0到高能級(jí)S1，然后粒子會(huì)弛豫到亞穩(wěn)態(tài)---高能級(jí)的z低點(diǎn)。接下來(lái)粒子會(huì)在這里停留很短的時(shí)間（短到幾個(gè)ns），然后粒子再回到低能級(jí)S0。這是絕大多數(shù)電子的選擇。跳下來(lái)的時(shí)候它們會(huì)降落在S0能級(jí)的不同高處，并形成一定的分布。還是在圖3中，如果綠色箭頭引發(fā)的熒光現(xiàn)象的z小PSF是綠色的圓圈半徑，這時(shí)候如果給它套上一個(gè)紅色橡皮擦（粒子做受激輻射波長(zhǎng)相同），那剩下的就是為數(shù)不多、居于中間的熒光了，這樣就縮小了點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，實(shí)現(xiàn)了超分辨。在實(shí)驗(yàn)操作上，選一種合適的熒光物質(zhì)，按順序先給激發(fā)脈沖(2ps左右)，等它躍遷上去了馬上給一個(gè)受激輻射波長(zhǎng)的脈沖（250ps左右），然后用二向色鏡區(qū)分受激輻射跟自發(fā)輻射，探測(cè)過(guò)來(lái)的自發(fā)輻射信號(hào)。受激輻射越大（橡皮擦得干凈），剩下的PSF越小，也就是分辨率越高。這個(gè)就是Pulsed STED.也可以給連續(xù)信號(hào)，因?yàn)槎蛏R都能區(qū)分，只不過(guò)擦得沒(méi)那么干凈了，這個(gè)就是CW STED。不同于STED需要經(jīng)過(guò)逐點(diǎn)掃描成像，SIM是一種寬場(chǎng)顯微成像技術(shù)，可以獲得更高的成像速度，更適合活體、低漂白的生物研究。SIM利用非均勻的正弦條紋照明光照明樣品，當(dāng)被測(cè)樣品精細(xì)形貌與條紋狀照明光相互疊加時(shí)，可以獲得一個(gè)比兩者空間頻率都低的“莫爾條紋”。而這個(gè)莫爾條紋中同時(shí)帶有樣品和照明光的信息，換句話說(shuō)，利用結(jié)構(gòu)光照明可以將無(wú)法被光學(xué)系統(tǒng)采集的高頻樣品信息編碼形成空間頻率相對(duì)較低、可以被收集的莫爾條紋信號(hào)。利用后期圖像重構(gòu)技術(shù)，樣品的高頻信息可以重現(xiàn)在所獲得的圖像上，從而實(shí)現(xiàn)了突破衍射J限的超分辨成像。同時(shí)利用多束光干涉的辦法，可以將二維結(jié)構(gòu)光照明成像擴(kuò)展到三維成像領(lǐng)域。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)橫向100nm，軸向200nm左右的分辨率。雖然 SIM的分辨率低于其他超分辨成像技術(shù)，但其方法簡(jiǎn)單，不需要特殊的熒光標(biāo)記，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)快速、動(dòng)態(tài)、三維的超分辨成像。

圖4：超分辨SIM的物理原理基于莫爾條紋和頻譜擴(kuò)展共聚焦通過(guò)一個(gè)點(diǎn)照明，加一個(gè)針孔實(shí)現(xiàn)分辨率提升。準(zhǔn)確地說(shuō)，由于在分辨率上，光噪聲總是帶來(lái)干擾，所以用一個(gè)針孔把光噪聲去除，就能夠?qū)⒎直媛侍嵘?。共聚焦可以提?.4倍分辨率，因?yàn)榧词贯樋仔〉街挥幸粋€(gè)點(diǎn)，根據(jù)光路可逆原理，這個(gè)點(diǎn)到了樣品上也有點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)那么大，z終，共聚焦的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)就是激發(fā)光的點(diǎn)擴(kuò)展乘以針孔點(diǎn)擴(kuò)展。共聚焦通過(guò)阻擋接收實(shí)現(xiàn)分辨率提升，而SIM則是通過(guò)給照明光一個(gè)調(diào)制實(shí)現(xiàn)分辨率提升。如果將SIM的結(jié)構(gòu)調(diào)制通過(guò)共軛放在接收端，則SIM也是一個(gè)一維調(diào)制。進(jìn)一步，通過(guò)從多個(gè)角度進(jìn)行一維限制，可以z終得到二維的分辨率提升。目前，比較流行的是每隔120度進(jìn)行一次，SIM可以提升2倍的分辨率。

圖5：SIM超分辨成像（右）總的來(lái)說(shuō)，由于光學(xué)衍射效應(yīng)所帶來(lái)的成像分辨率的限制，通過(guò)單分子定位和改造光學(xué)系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的方式，犧牲一定時(shí)間分辨率來(lái)獲得突破衍射J限的成像，是目前的主流方法。除上述所提到的依據(jù)熒光成像原理的遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨成像技術(shù)外，采用近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微技術(shù)(NSOM)也可以獲得突破衍射J限的成像。近場(chǎng)光學(xué)成像不同于經(jīng)典光學(xué)，其探針距樣品僅波長(zhǎng)量級(jí)的長(zhǎng)度，可以收集遠(yuǎn)場(chǎng)成像所收集不到的近場(chǎng)信息，進(jìn)而獲得與原子力顯微鏡相當(dāng)?shù)某上穹直媛省? 國(guó)內(nèi)對(duì)超分辨成像技術(shù)的研究進(jìn)展目前國(guó)內(nèi)對(duì)超分辨成像技術(shù)已經(jīng)展開(kāi)了廣泛而深入的研究。

圖6：DMD-SIM實(shí)驗(yàn)光路圖中國(guó)科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所采用數(shù)字微鏡器件（DMD）和LED照明的結(jié)構(gòu)光照明方案，減少了散斑干涉等不利因素造成的背景噪聲，能夠獲得90nm的空間分辨率以及190ms的切片速度。

圖7：兩種方法提高活細(xì)胞顯微成像的分辨率。左圖：雙色高數(shù)值孔徑物鏡的全內(nèi)反射結(jié)構(gòu)光顯微成像技術(shù)（highNA TIRF-SIM）。紫色：激動(dòng)蛋白（actin）；綠色：內(nèi)吞小泡（CCP）。右圖：基于非線性激活Skylan-NS標(biāo)記的激動(dòng)蛋白的非線性結(jié)構(gòu)光照明（PA NL-SIM）成像。2015年，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所與美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所等單位的科學(xué)家在《科學(xué)》上發(fā)表利用一種新型反復(fù)激活熒光蛋白Skylan-NS和結(jié)構(gòu)光激活非線性SIM技術(shù)，獲得了在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和改變形狀的過(guò)程中骨架蛋白的解體和自組裝過(guò)程，以及在細(xì)胞膜表面稱為“caveolae”的微小內(nèi)吞體動(dòng)態(tài)過(guò)程的影像，其分辨率能達(dá)到62nm。

圖8：寬場(chǎng)成像和超分辨JT-SOFI成像的比較（Scale bar:1um）2015年，北京大學(xué)席鵬結(jié)合了量子點(diǎn)、光譜方法和SOFI超分辨技術(shù)，在普通寬場(chǎng)顯微鏡上，實(shí)現(xiàn)了3s獲得85nm的超高時(shí)空分辨率的成像，使用不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)的聯(lián)合標(biāo)記，有效減少了高階成像的偽影，更加真實(shí)地還原出生物樣品的完整結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)信息。

圖9: 納米線環(huán)形照明顯微術(shù)機(jī)理示意圖(a)及“ZJU”結(jié)構(gòu)觀察效果圖(b)

2017年，浙江大學(xué)楊青、劉旭將納米線作為局域光源，提出了一種稱為“納米線環(huán)形照明顯微術(shù)”(Nanowire ring illumination microscopy, NWRIM)的技術(shù)，頭次實(shí)現(xiàn)了大視場(chǎng)、無(wú)標(biāo)記的超分辨成像，其視場(chǎng)目前達(dá)數(shù)千平方微米，比以往報(bào)道的無(wú)標(biāo)記型遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨顯微方法擴(kuò)展了1個(gè)數(shù)量級(jí)以上。

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